Am 23. Oktober 1853 rollte zum ersten Mal eine Lokomotive über die gesamte Strecke. Am 16. Mai 1854 befuhr das Kaiserpaar die Verbindung, am 17. Juli 1854 wurde die Bahn feierlich eröffnet und dem allgemeinen Personenverkehr übergeben. Bis heute hat sich an der Streckenführung nicht viel geändert. Nur der Semmeringtunnel musste neu gebaut werden. Durch Wassereinbrüche waren Teile des Bauwerks einsturzgefährdet. So wurde 1952 der neue Tunnel mit einer Länge von 1.511 Metern eröffnet.
1998 wurde die Semmeringbahn vom UNESCO-Welterbe-Komitee zum Weltkulturerbe erklärt. Die Begründung lautete, dass die Verbindung "eine herausragende technische Lösung eines großen physikalischen Problems in der Konstruktion früherer Eisenbahnen" repräsentiere. Zur Erinnerung an den Erbauer Carl Ritter von Ghega steht ein Denkmal am Bahnhof Semmering.